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本试剂盒用带生物素标记的dNTP进行PCR扩增，这些dNTP掺入到PCR产物中之后，扩增得到的DNA片段自然就带有生物素标记，得到的生物素标记DNA探针可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落杂交和斑点印迹杂交等分析。

• 一站式，本试剂盒经过精心优化，不需要用户自己摸索标记条件。
  
• 优化的生物素掺入率，能有效降低探针中生物素分子之间的可能空间阻碍，检测效果佳。
  
• 既可用于制备双链DNA探针，也可以用于制备单链DNA探针。
  
• 一次标记反应可以得到μg级的生物素标记双链DNA探针或约700ng生物素标记单链DNA探针，足够多次杂交实验用。

• 按常规的方法设计PCR引物，使PCR产物（探针）长度在400～800bp之间。过短则生物素标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
  
• 为保证成功率，最好先用常规PCR产物制备DNA片段，再以之为模板进行标记PCR反应。不推荐以基因组DNA或其他背景复杂的DNA为模板直接进行PCR标记反应。

• 用常规PCR制备模板
  
  • 用自备的PCR试剂盒按下表配制50μL的常规PCR反应以制备标记PCR模板：
    

    成分	用量
    自备的2×PCR Mix(含酶，含dNTP)	25μL
    引物一和引物二(10pmol/μL)	各5μL
    1μg基因组DNA或1ng质粒DNA	1μL
    超纯水	至50μL

  • 按引物Tm值设计的PCR参数进行常规PCR。
    
  • 用自备胶回收试剂盒回收常规PCR产物并定量。胶回收步骤可以去残留引物，避免这些引物干扰后续的标记PCR反应。
• 标记PCR反应
  
  • 按下表加入各成分配制反应体系。
    

    成分	标记PCR	常规PCR(自备)
    标记专用PCR Mix(含酶)	6μL	6μL
    含Biotin-11-dUTP的dNTP(2.5mM each)	5μL	不加
    dNTP Mix(2.5mM each)	不加	5μL
    若双链标记，加引物一和引物二； 若单链标记，只加一条引物	各50pmol	各50pmol
    胶回收所得PCR产物	10ng(双链标记) 100ng(单链标记)	10ng(双链标记) 100ng(单链标记)
    超纯水	至50μL	至50μL

    • 由于双链PCR探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记PCR。在设置标记PCR时必须做一个常规PCR对照。
  • 由于此步所用的PCR引物和第1步的PCR引物完全一样，故可以参考第1步PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35～55个循环，使扩增得到的探针DNA片段参差不齐，杂交时这种DNA能形成网络结构，杂交效果比长度整齐的DNA更好；二是延伸步骤的时间增加15秒，因为标记dUTP掺入到DNA的速度比常规的dTTP慢，增加延伸步骤的时间可以保证更多的标记dUTP掺入到合成的DNA探针中；三是降低复性温度5～7℃，因为标记核苷酸掺入到DNA后，含标记核苷酸的DNA的Tm值将比正常的DNA低。
    
  • PCR结束后，取标记PCR反应液和对照反应液3～5μL进行琼脂糖凝胶电泳（一定要使用浓度已知的DNA marker），检测标记是否成功。由于标记DNA含有额外的标记物、分子量更大，其泳动速度将慢于常规PCR产物。
    
  • 探针的定量：电泳所用的DNA marker浓度已知，上样体积已知，故上样量已知，就可通过双链探针DNA和DNA marker对应条带的相对亮度来估计探针DNA浓度。例如，如果探针长度为500bp，而marker中500bp这条带的浓度是10ng/μL，共上样10μL，则500bp这条带的上样量为100ng。标记的探针DNA在紫外下亮度只有它的一半，则探针DNA的上样量为100/2=50ng，如果上样量是5μL，则探针的浓度是50/5=10ng/μL。但是，如果制备的是单链DNA探针，则不能按此法估计浓度，因为单链DNA结合核酸染料（如EB和SYBR GreenI）的能力远低于双链DNA。但可采用银染法定量（跟marker比较）。一般100ng模板经单链标记PCR扩增可得到700ng左右的单链探针。
    
  • 单链PCR标记产物可以不经过纯化直接加入到杂交液中，双链PCR标记产物需要加热到95～100℃ 5分钟变性然后放冰上急冷后再加入到杂交液中使用。
    
  • 如果探针不立即使用，需要放-20℃长期保存，不能放常温保存，否则Taq DNA酶的残留的外切酶活性会降解探针DNA。如果需要纯化探针DNA，请使用探针纯化试剂盒。

• 这个合成的标记DNA探针能不能用来做DNA pull down？
  可以。但由于标记核苷酸的掺入是随机的，大部分探针的结合位点处的核苷酸是不带标记分子的，但有少数探针该区域是带标记分子的，它们肯定会干扰该DNA区域与蛋白的结合，故实验时可能需要加入更多的探针DNA。具体用量需要自行优化。